10 Analiza skladu tluszczowcow, ♦ Nauka, Biotechnologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
10.
ANALIZA SKŁADU
TŁUSZCZOWCÓW
1. Identyfikacja lecytyny
Fosfatydylocholin
ę
mo
Ŝ
na zidentyfikowa
ć
i odró
Ŝ
ni
ć
od innych glicerofosfoli-
pidów poprzez wskazanie jej charakterystycznych składników, czyli choliny
i fosforanu. Dzi
ę
ki tym składnikom, tj.: fosfocholinie o charakterze hydrofilnym,
lecytyna tworzy w wodzie do
ść
trwałe emulsje. Lecytyna zawiera równie
Ŝ
kwa-
sy tłuszczowe, ich obecno
ść
jest charakterystyczna dla wszystkich tłuszczow-
ców, zawiera te
Ŝ
glicerol, który jest składnikiem wszystkich glicerolipidów.
1.1. Wykrywanie choliny
Zasada:
W
ś
rodowisku silnie zasadowym lecytyna ulega hydrolizie, uwolnion
ą
cholin
ę
mo
Ŝ
na zidentyfikowa
ć
. Cholina jest czwartorz
ę
dowym kationem amoniowym,
który w tych warunkach rozpada si
ę
do trimetyloaminy i glikolu etylenowego.
O H
-
+
C H
3
O H
-
C H
3
H O C H
2
C H
2
N C H
3
C H
3
H
3
C N
H O C H
2
C H
2
O H
C H
3
Trimetyloamina ma charakterystyczny zapach solanki
ś
ledziowej, który pozwa-
la zidentyfikowa
ć
obecno
ść
choliny w fosfolipidach.
Wykonanie:
Przygotowa
ć
dwie probówki, do których wprowadzi
ć
:
– do pierwszej probówki 5 kropli etanolowego roztworu lecytyny,
– do drugiej probówki 5 kropli etanolu (próba
ś
lepa).
·
Do obu probówek doda
ć
po 5 ml 20% roztworu NaOH.
·
Ogrzewa
ć
około 5 minut we wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej. Wydziela si
ę
lotna trimety-
loamina o charakterystycznym zapachu solanki
ś
ledziowej, co wskazuje na
obecno
ść
choliny w analizowanej próbie.
1
·
1.2. Wykrywanie fosforanów
Zasada:
Wykrywanie ortofosforanów w zwi
ą
zkach organicznych, w tym równie
Ŝ
w fos-
folipidach, jest skuteczne po zmineralizowaniu zwi
ą
zku. W wyniku spalenia
prób fosforanów organicznych w osadzie pozostaj
ą
tlenki ró
Ŝ
nych pierwiast-
ków, tak
Ŝ
e P
2
O
5
. Wyługowany z osadu bezwodnik kwasu fosforowego, po za-
kwaszeniu st
ęŜ
onym kwasem azotowym (V) reaguje z molibdenianem amono-
wym, tworz
ą
c fosfomolibdenian amonowy (NH
4
)
3
P(Mo
3
O
10
)
4
]
2H
2
O, czyli
(NH
4
)
3
PO
4
12MoO
3
o barwie
Ŝ
ółtej.
H
3
PO
4
+ 12(NH
4
)
2
MoO
4
+ 23HNO
3
®
(NH
4
)
3
[P(Mo
3
O
10
)
4
]
×
2H
2
O
¯
+
+ 21NH
4
NO
3
+ 2HNO
3
+ 10H
2
O
Wykonanie:
·
Do suchego tygla porcelanowego wprowadzi
ć
1 ml alkoholowego roztworu
lecytyny, pod dygestorium odparowa
ć
etanol, podgrzewaj
ą
c tygiel na płytce
elektrycznej, po czym doda
ć
3-krotn
ą
ilo
ść
mieszaniny spalaj
ą
cej KNO
3
/Na
2
CO
3
(w stosunku 2:3) i prób
ę
stopi
ć
.
Uzyskany stop rozpu
ś
ci
ć
w 2–3 ml gor
ą
cej wody i przes
ą
czy
ć
. Do przes
ą
czu
doda
ć
w nadmiarze st
ęŜ
onego HNO
3
i 2 ml 10% roztworu molibdenianu
amonu. Zawarto
ść
probówki ogrza
ć
do wrzenia w ła
ź
ni wodnej.
W trakcie ogrzewania pojawia si
ę
Ŝ
ółto zabarwiony fosfomolibdenian amo-
nowy, który przy wi
ę
kszych st
ęŜ
eniach wytr
ą
ca si
ę
w postaci krystalicznego
Ŝ
ółtego osadu.
2. Wykrywanie sterydów i karotenów
2.1. Wykrywanie cholesterolu
Zasada:
Cholesterol (zawieraj
ą
cy wi
ą
zanie podwójne) pod wpływem st
ęŜ
onego kwasu
siarkowego ulega odwodnieniu, odł
ą
czana jest cz
ą
steczka wody i pojawiaj
ą
si
ę
sprz
ęŜ
one wi
ą
zania podwójne odpowiedzialne za pojawienie si
ę
barwy.
W od-
czynie Salkowskiego
powstaje kwas disulfonowy bicholestadienu o barwie
czerwonej.
2
·
HO
3
S
SO
3
H
W
odczynie Liebermanna-Burcharda
w obecno
ś
ci kwasu siarkowego i bez-
wodnika kwasu octowego powstaje zielono zabarwiony kwas monosulfonowy
bicholestadienu. Reakcja ta jest wykorzystywana do ilo
ś
ciowego oznaczania
cholesterolu w płynach biologicznych.
SO
3
H
W obu reakcjach zachodzi odwodnienie cz
ą
steczek cholesterolu. Obecno
ść
ś
la-
dów wody uniemo
Ŝ
liwia przebieg reakcji. Analizy te nale
Ŝ
y przeprowadza
ć
,
u
Ŝ
ywaj
ą
c suchych probówek i pipet.
Wykonanie odczynu Salkowskiego:
Przygotowa
ć
cztery suche probówki zawieraj
ą
ce po 1 ml chloroformu. Doda
ć
do nich:
– 5 kropli 2% chloroformowego roztworu cholesterolu – do pierwszej,
– 5 kropli rozpuszczonego masła – do drugiej,
– 5 kropli lecytyny – do trzeciej,
– 5 kropli oleju – do czwartej.
·
Wszystkie probówki dokładnie wymiesza
ć
przez wytrz
ą
sanie.
·
Nast
ę
pnie do ka
Ŝ
dej próby podwarstwi
ć
(przez swobodne spłyni
ę
cie po
ś
cian-
ce pochylonej probówki) 0,5 ml st
ęŜ
onego kwasu siarkowego.
·
Warstwa chloroformowa barwi si
ę
na kolor malinowy, natomiast dolna war-
stwa wykazuje zielon
ą
fluorescencj
ę
.
·
Porównaj barwy poszczególnych prób, zinterpretuj uzyskane wyniki.
3
·
Wykonanie odczynu Liebermanna-Burcharda:
·
Do suchej probówki zawieraj
ą
cej 1 ml 2% chloroformowego roztworu chole-
sterolu doda
ć
10 kropli bezwodnika kwasu octowego i 1 kropl
ę
st
ęŜ
onego
kwasu siarkowego. Wymiesza
ć
. Pojawiaj
ą
ca si
ę
barwa czerwona przechodzi
w barw
ę
niebiesk
ą
, a nast
ę
pnie w zielon
ą
.
2.2. Wykrywanie hormonów steroidowych
Zasada:
,21-dihydroksy-20-okso, czyli: 11-deoksykortyzol, kortyzol i korty-
zon, w
ś
rodowisku kwa
ś
nym reakcji Portera i Silbera z fenylohydrazyn
ą
tworz
ą
3,20- lub 3,21-fenylohydrazony o barwie
Ŝ
ółtobrunatnej. Grupa 17-oksosteroi-
dów (do której nale
Ŝą
metabolity m
ę
skich hormonów płciowych oraz niektóre
nadnerczowe steroidy C19) charakteryzuje si
ę
obecno
ś
ci
ą
grupy ketonowej
przy C17, która w
ś
rodowisku zasadowym reakcji Zimmermanna daje czerwo-
no zabarwiony produkt kondensacji z m-dinitrobenzenem. Wszystkie estrogeny,
czyli steroidy C18: estradiol, estron, estriol, maj
ą
w swej strukturze aromatycz-
ny pier
ś
cie
ń
A oraz grup
ę
hydroksylow
ą
o charakterze fenolowym w tym pier-
ś
cieniu, które w obecno
ś
ci st
ęŜ
onego kwasu siarkowego i hydrochinonu tworz
ą
barwne produkty w reakcji Kobera.
a
Wykonanie próby Portera i Silbera:
· Przygotowa
ć
dwie probówki zawieraj
ą
ce po:
– 0,5 ml 0,005% etanolowego roztworu kortyzolu – w pierwszej,
– 0,5 ml etanolu (
ś
lepa) – w drugiej.
·
Do obu prób doda
ć
po 1,5 ml 0,065% roztworu fenylohydrazyny w kwasie
siarkowym (62%).
·
Próby ogrzewa
ć
we wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej przez 30 minut. Dodatni odczyn jest
wówczas, gdy pojawia si
ę
Ŝ
ółtobrunatne zabarwienie próby.
4
Chemiczne odró
Ŝ
nienie nieznacznych ró
Ŝ
nic w strukturze hormonów steroido-
wych jest ograniczone, szczególnie w płynach biologicznych, które zwykle s
ą
mieszanin
ą
wielu steroidów. Hormony steroidowe C21, które zawieraj
ą
ugrupo-
wania 17
Reakcja Zimmermanna:
O H
N O
2
K O H
N O
2
N O
2
N
O
-
K
+
O
O
H
3
C
17
H
3
C
O
O
H
3
C
H
H
3
C
O
N
O
-
K
+
O
N O
2
barwny kompleks
Wykonanie próby Zimmermanna:
Przygotowa
ć
dwie probówki zawieraj
ą
ce po:
– 0,5 ml etanolowego roztworu androsteronu (6x10
-4
%) – w pierwszej,
– 0,5 ml etanolu (
ś
lepa) – w drugiej probówce.
· Do obu prób doda
ć
po 0,5 ml 1% etanolowego roztworu m-dinitrobenzenu,
wymiesza
ć
, po czym do obu doda
ć
po: 0,5 ml 8 M roztworu NaOH w celu za-
lkalizowania.
·
Dodatni odczyn jest wówczas, gdy pojawia si
ę
czerwone zabarwienie próby,
które pogł
ę
bia si
ę
w czasie przetrzymywania (do 20 min) prób w ciemno-
ś
ci w temperaturze pokojowej.
Wykonanie próby Kobera:
Przygotowa
ć
dwie probówki zawieraj
ą
ce po:
– 0,5 ml 0,005% etanolowego roztworu estradiolu – w pierwszej,
– 0,5 ml etanolu (
ś
lepa) – w drugiej probówce.
·
Do obu prób doda
ć
po 2 ml 4% roztworu hydrochinonu w st
ęŜ
onym kwasie
siarkowym, wymiesza
ć
i wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej na 10 minut.
5
·
·
[ Pobierz całość w formacie PDF ]