105LC rozdzielanie peptydow i bialek, WIiTCh PK, Chemia analityczna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
kolumnowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-15 23:20 Page 105
7. KOLUMNOWA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA W
ROZDZIELANIU PEPTYDÓW I BIA£EK
Daniel Jastrzêbski, Marian Kamiñski
7.1.
WPROWADZENIE
Peptydy i bia³ka maj¹ ogromne znaczenie w organizmach ¿ywych jako enzymy, hormony,
przeciwcia³a i inne sk³adniki komórek i p³ynów fizjologicznych. Niektóre peptydy wykazuj¹
aktywnoœæ antybiotyczn¹.
Koniecznoœæ uzupe³niania braków okreœlonych peptydów i bia³ek w organizmie lub
stosowania peptydowych antybiotyków, albo innych leków peptydowych, poci¹ga za sob¹
potrzebê otrzymywania tych substancji w formie biologicznie aktywnej. Najczêœciej wymagana
jest równoczeœnie bardzo wysoka czystoœæ izolowanych substancji. Peptydy i bia³ka mo¿na
otrzymaæ w sposób tradycyjny, wyodrêbniaj¹c je z tkanek zwierzêcych (w tym ludzkich), a
niekiedy tak¿e z roœlin. Ostatnio, roœnie znaczenie chemicznych, a szczególnie biotechnolog-
icznych metod syntezy peptydów i bia³ek.
£atwiejsza czêsto do opracowania jest metodyka oznaczania zawartoœci wyodrêbnianych
substancji w pó³produktach oraz w finalnym produkcie. Trzeba jednak mieæ œwiadomoœæ, ¿e jest
to tak¿e problem, wymagaj¹cy czêsto znacznego nak³adu pracy eksperymentalnej.
Wœród ró¿nych sposobów rozdzielania peptydów i bia³ek dominuj¹ce znaczenie identy-
fikacyjne i analityczne posiadaj¹ metody elektroforetyczne. Wa¿ne i ci¹gle rosn¹ce znaczenie ma
te¿ wykorzystanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Chromatografia cieczowa bywa u¿ywana w zastosowaniach analitycznych szczególnie do
identyfikacji i oznaczania zawartoœci peptydów o niskich masach cz¹steczkowych, które trudno
rozdzieliæ w warunkach elektroforezy ¿elowej.
Ogromn¹ karierê robi obecnie stosowanie HPLC - MS w proteomice do identyfikacji
bia³ek na podstawie sk³adu peptydów po dzia³aniu na bia³ko trypsyn¹ w œciœle kontrolowanych
warunkach (
tripsine digestion peptide mapping
). Analityka przebiega w warunkach elucji gra-
dientowej z zastosowaniem kolumn HPLC o szczególnie wysokiej sprawnoœci i odbywa siê z
regu³y trybie prze³¹czania kolumn. Rys 7.1. przedstawia przyk³ad chromatogramu rozdzielania
peptydów powsta³ych z kazeiny pod dzia³aniem trypsyny. Jest to swego rodzaju “odcisk palca”
bia³ka poddanego dzia³aniu trypsyny. W powi¹zaniu z odpowiednimi bazami danych biolodzy i
biotechnolodzy uzyskali ostatnio szczególnie efektywne narzêdzie badañ bazuj¹ce na HPLC. W
ostatnim czasie mo¿na znaleŸæ wiele publikacji, dotycz¹cych zasad stosowania HPLC w zakre-
sie proteomiki.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
105
Dobór odpowiedniej techniki rozdzielania potrzebnych peptydów i bia³ek od
zanieczyszczeñ, a nastêpnie optymalnych warunków wyodrêbniania, zapewniaj¹cych otrzy-
manie produktu o najwy¿szej aktywnoœci biologiczne stanowi z regu³y trudny problem separa-
cyjny.
kolumnowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-15 23:20 Page 106
Kolumnowa chromatografia cieczowa w rozdzielaniu peptydów i bia³ek
Rys. 7.1. Przyk³ad chromatogramu otrzymanego podczas rozdzielenia peptydów powsta³ych z kazeiny
po dzia³aniu trypsyn¹. Kolumna Jupiter Proteo 90A C185 mm, 250x4mm; Warunki rozdzielania: eluc-
ja gradientowa - program liniowy od 20% AcCN w H
2
O do 70% AcCN w H
2
O;
w
= 1 ml/min; Detek-
tor UV 220 nm; Temperatura 10°C - “
HPLC columns for the proteomic era
”.
Chromatografia cieczowa w skali preparatywnej i procesowej, ma w zastosowaniu do
bia³ek i peptydów wa¿ne znaczenie preparatywne oraz produkcyjne. Coraz czêœciej mo¿na dzi-
siaj spotkaæ w halach przemys³owych zak³adów farmaceutycznych, instalacje, wykorzystuj¹ce
kolumny chromatograficzne i chromatografiê cieczow¹ w skali procesowej do rozdzielania pep-
tydów i bia³ek oraz nie tylko tych substancji.
Do rozdzielania peptydów i bia³ek z zastosowaniem chromatografii cieczowej wyko-
rzystywane s¹ praktycznie wszystkie znane uk³ady chromatograficzne. Stosowana jest chro-
matografia ¿elowa (GPC -
gel permeation chromatography
, albo SEC -
size exclusion chro-
matography
), chromatografia jonowymienna (IEC -
ion exchange chromatography
, w tym, chro-
matografia wykluczania jonowego - i
on exclusion chromatography
). Wykorzystuje siê chro-
matografiê adsorpcyjn¹, najczêœciej w uk³adach faz odwróconych w “klasycznej” postaci (RP-
HPLC -
reverse phase high performance chromatography
) oraz chromatografiê oddzia³ywañ
hydrofobowych (HIC -
hydrophobic interaction chromatography
), a nawet chromatografiê
adsorpcyjn¹ w uk³adach faz normalnych (NP-HPLC -
normal phase high performance chro-
matography
), szczególnie, z chemicznie zwi¹zan¹ faz¹ stacjonarn¹. Dodatkowo, bardzo szerok-
ie zastosowanie znajduj¹ metody chromatografii powinowactwa (
Affinity Chromatography
-
AC), jako odrêbna grupa metod separacyjnych o szczególnie wysokiej selektywnoœci i specy-
ficznoœci.
W literaturze opisano wiele procedur rozdzielania, które s¹ aktualne dla konkretnego prob-
lemu rozdzielczego, tzn. do rozdzielania konkretnych peptydów, bia³ek i ich zanieczyszczeñ. Nie
opracowano, jednak, dotychczas w sposób zadowalaj¹cy, takich ogólnych regu³, które umo¿li-
wia³yby dobór odpowiednich warunków rozdzielania w zale¿noœci od pierwszo - i wy¿ej rzê-
dowej struktury rozdzielanych peptydów i bia³ek.
Analizuj¹c literaturê prezentuj¹c¹ warunki rozdzielania peptydów i bia³ek mo¿na, jednak,
zauwa¿yæ pewne dominuj¹ce kierunki postêpowania i na tej podstawie przedstawiæ uogólnione
zasady doboru warunków rozdzielania tych substancji z zastosowaniem chromatografii cieczo-
wej.
106
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
Dalej omówiono stosowane najczêœciej sposoby wp³ywania na selektywnoœæ i sprawnoœæ
uk³adu chromatograficznego w przypadku najwa¿niejszych metod rozdzielania peptydów i
bia³ek z wykorzystaniem elucyjnej chromatografii cieczowej
kolumnowa chromatografia cieczowa.qxp 2004-06-15 23:20 Page 107
Kolumnowa chromatografia cieczowa w rozdzielaniu peptydów i bia³ek
7.2.
EFEKTY I ZJAWISKA WP£YWAJ¥CE NA SELEKTYWNOŒÆ
ROZDZIELANIA PEPTYDÓW I BIA£EK W WARUNKACH
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ ORAZ PRZYK£ADY CZÊSTO
STOSOWANYCH WARUNKÓW ROZDZIELANIA
Peptydy i bia³ka s¹, jak wiadomo, jednoczeœnie kwasami i zasadami. W strukturze
cz¹steczki z³o¿onej z
n
aminokwasów wystêpuje
n
-1 wi¹zañ peptydowych, a tak¿e mo¿liwoœæ
istnienia tzw. mostków disiarczkowych oraz wewnêtrznych wi¹zañ wodorowych, determinuj¹-
cych drugo- i trzecio- rzêdow¹ strukturê cz¹steczki. Obecnoœæ aminokwasów zawieraj¹cych
hydrofobowe fragmenty wp³ywa na wzrost ogólnej hydrofobowoœci cz¹steczki peptydu / bia³ka.
W zale¿noœci od pH rozpuszczalnika mo¿e mieæ miejsce dysocjacja protonu od zewnêtrznej
grupy karboksylowej (pH powy¿ej punktu izoelektyrycznego) lub protonowanie n-terminalnej
grupy aminowej (pH poni¿ej punktu izoelektrycznego), albo szczególnie silne obni¿enie roz-
puszczalnoœci peptydu dla pH odpowiadaj¹cego punktowi izoelektrycznemu.
Dysocjacja elektrolityczna peptydów i bia³ek oraz znaczne spolaryzowanie wi¹zañ pepty-
dowych powoduje, ¿e substancje te - w zale¿noœci od pH oraz sk³adu rozpuszczalnika, mog¹
tworzyæ pary jonowe oraz byæ solwatowane przez substancje bêd¹ce donorem elektronów, jaki i
przez akceptory elektronów. Gdy cz¹steczki substancji tworz¹cych z peptydem parê jonow¹, albo
solwatuj¹cych peptyd posiadaj¹ czêœæ niepolarn¹, to w wyniku solwatacji mo¿e nastêpowaæ
zasadniczy wzrost hydrofobowoœci agregatu. Znaczny wzrost hydrofobowoœci, zwi¹zany z tzw.
zjawiskiem “wysalania”, ma te¿ miejsce w przypadku umieszczenia bia³ka w bardzo stê¿onym
roztworze soli.
Wszystkie te zjawiska maj¹ wp³yw na zachowanie siê cz¹steczek peptydów i bia³ek w
roztworach oraz na ich oddzia³ywania z faz¹ stacjonarn¹ w ró¿nych uk³adach chro-
matograficznych. Dodatkowo komplikowaæ mo¿e sytuacjê tendencja niektórych peptydów i
bia³ek do kondensacji i tworzenia w okreœlonych warunkach wysokomolekularnych agregatów.
Na retencjê i na stopieñ rozdzielenia peptydów i bia³ek ma, wiêc, wp³yw szereg para-
metrów uk³adu chromatograficznego, takich, jak: typ powierzchni sorpcyjnej wype³nienia
kolumny i uboczne oddzia³ywania na powierzchni sorbentu, powierzchnia w³aœciwa fazy
stacjonarnej, wielkoœæ i porowatoœæ ziaren wype³nienia kolumny, sk³ad, pH, temperatura i prêd-
koœæ przep³ywu eluentu, oddzia³ywania dodatkowych sk³adników eluentu, w tym stê¿enie soli w
eluencie, przebieg programu elucji i inne parametry, w tym, nawet ciœnienie podczas rozdziela-
nia.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
107
W tabeli 7.1 zestawiono reprezentatywne przyk³ady warunków stosowania chromatografii
cieczowej do rozdzielania peptydów / bia³ek w ró¿nych uk³adach. Dane te obejmuj¹ bardzo czês-
to wykorzystywane warunki rozdzielania i mog¹ byæ przewodnikiem, przydatnym dla wstêpnego
doboru warunków przy rozwi¹zywaniu problemów rozdzielczych, dotycz¹cych peptydów i
bia³ek.
Na podstawie danych zawartych w tabeli 1 widaæ, ¿e prawie wszystkie znane uk³ady chro-
matograficzne s¹ wykorzystywane do rozdzielania peptydów i bia³ek. Jednak, najczêœciej
stosowane s¹ uk³ady faz odwróconych oraz chromatografia jonowymienna. Wstêpna separacja
jest wykonywana z wykorzystaniem chromatografii ¿elowej, szczególnie z wykorzystaniem
“twardych” sorbentów typu DIOL, ostatnio g³ównie takich, których struktura porowata bazuje
ma “matrycy” z porowatego di-tlenku cyrkonu, albo di-tlenku tytanu. Dodatkowo, nale¿y zwró-
ciæ uwagê, ¿e do rozdzielenia i wyodrêbniania bia³ek stosowana jest te¿ czêsto chromatografia
oddzia³ywañ hydrofobowych (HIC) oraz szeroko jest wykorzystywana chromatografia
powinowactwa.
Lp. Uk³ad chromatograficzny
Warunki rozdzielania
Substancje rozdzielane
Uwagi
1 Uk³ad faz odwróconych (RP); Kolumna C-18 300A 250x4,6 mm (1,6 µm),
T=20°C,
w
=0,6 ml/min,
Eluenty: A - 0,1% TFA w H
2
O,
B - 0,1% TFA w AcCN,
Program elucji: 0-48 min - 39-45% B,
Detekcja UV 220-280 nm;
interferon γ IFNγ i jego analog
AII
Kolumna C-4 300A (15µm),
T=36°C,
w
=2 ml/min,
Eluenty: A - bufor fosforanowy
pH 7 + odpowiednia sól,
B - 30% iPr w A,
Program elucji: 0-40 min - 0-100% B,
Detekcja UV 280 nm;
bovine pancreatic trypsin
inhibitor BPTI w grupie mod-
elowych peptydów
Warunki oddzia³ywañ
hydrofobowych (HIC) -
dodatek ró¿nych soli do
eluentu A (NaCl, NaAc,
(NH
4
)
2
SO
4
)
Kolumny C-8 150x4,6 mm (5µm)
+ C-18 250x4,6 mm (5µm), T=21°C,
w
=1 ml/min,
Eluenty: A - 9% MeOH
+ 70 mM AcNa, pH 5,75,
B - 90% MeOH, 8,2% H
2
O,
1,8% iPr,
Program elucji: 0-15 min 10-40% B,
15-35 min 40-80% B,
Detekcja FLD, wzb. 330 nm, em. 450 nm;
F-β-Ala i β-Ala
RP MPLC z wykorzy-
staniem dwóch ró¿nych
kolumn
Kolumna C-18 300A 150x4,6 mm (5µm),
T=40°C,
w
=1,0 ml/min,
Eluenty: A - 0,1% TFA w H
2
O,
B - 0,085% TFA w AcCN,
Program elucji: start od 5% B, prêdkoœæ
przyrostu stê¿enia od 1% do 3%/min,
Detekcja UV 280 nm;
Tabela 7.1. Przyk³ady praktycznego zastosowania HPLC do rozdzielania peptydów i bia³ek wraz z warunkami
chromatograficznymi.
cd na str. 109
cd ze str. 108
cd na str. 110
Kolumna C-4 300A 150x2,1 mm (5µm),
T=400°C,
w
=0,25 ml/min,
Eluenty: A - 10% AcCN +
0,1% TFA w H
2
O,
B - 10% H
2
O + 0,1% TFA
w AcCN
Program elucji: 0-7 min - 26,5-28,6% B,
7-17 min - 28,6-30,6% B,
17-28 min - 30,6-36,1% B,
28-46 min - 36,1-43,3% B,
Detekcja UV 214 nm;
Oznaczenie jakoœciowe i iloœ-
ciowe bia³ek w mleku
2 Chromatografia
jonowymienna
Kolumny EMD SO
3
-
, EMD COO
-
,
Spherodex, Sepharose, 60x10 mm,
T=50°C,
w
=2 ml/min,
Eluent: 0,3M NaCl w 10 mM Na3PO4,
pH 7,
Detekcja UV 280 nm;
Chromatografia kationo-
wymienna - porównanie
selektywnoœci ró¿nych
kationitów wobec bia³ek
lysozyme, α-chymotropsino-
gen A, cytochrome C,
Kolumna DEAE 50x7,5 mm,
w
=1 ml/min,
Eluenty: A - 0,05 M Tris HCl w H
2
O, pH 8,
B - 0,05 M Tris HCl +
0,5 M NaCl w H
2
O, pH 8,
Program elucji: 0-60 min - 0-100% B,
Detekcja UV 260 nm;
peptydowe kwasy nukleinowe
- PNAs
Chromatografia
anionowymienna
3 Chromatografia ¿elowa
Kolumna: Superose 6, 300x10 mm,
temperatura pokojowa,
w
=0,5 ml/min,
Eluent: 200 mM NaCl + 15 mM Tris HCl w
H
2
O, pH 7.4,
Detekcja UV 280 nm;
Thyroglobin, immunoglobulin
G, ovalbumin, myoglobulin
Bia³ka o wysokich masach
cz¹steczkowych
[ Pobierz całość w formacie PDF ]